Racun oray ngandung énzim anu ngahidrolisis beungkeut éster karboksil.Substrat pikeun hidrolisis nyaéta fosfolipid, asetilkolin sareng asetat aromatik.Énzim ieu kalebet tilu jinis: fosfolipase, acetylcholinesterase sareng ésterase aromatik.Arginin ésterase dina venom oray ogé bisa ngahidrolisis arginin sintétik atawa lisin, tapi utamana ngahidrolisis beungkeut péptida protéin di alam, jadi milik protease.Énzim anu dibahas di dieu ngan ukur dianggo dina substrat éster sareng henteu tiasa dianggo dina beungkeut péptida.Diantara énzim ieu, fungsi biologis acetylcholinesterase sareng fosfolipase langkung penting sareng parantos ditaliti sacara lengkep.Sababaraha racun oray gaduh aktivitas ésterase aromatik anu kuat, anu tiasa ngahidrolisis p-nitrofenil étil éster, a - atanapi P-naftalena asétat sareng étil éster indole.Henteu dipikanyaho naha kagiatan ieu dihasilkeun ku énzim mandiri atanapi éfék samping carboxylesterase, sumawona signifikansi biologisna.Nalika racun Agkistrodon halys Japonicus diréaksikeun sareng p-nitrophényl étil éster sareng indole étil éster, hidrolisat p-nitrofenol sareng indole fénol henteu kapendak;Sabalikna, lamun éster ieu diréaksikeun jeung kobra Zhoushan subspésiés venom oray jeung Bungarus multicinctus venom oray, aranjeunna bakal gancang dihidrolisis.Perlu dipikanyaho yén racun kobra ieu gaduh kagiatan kolinesterase anu kuat, anu tiasa tanggung jawab pikeun hidrolisis substrat di luhur.Kanyataanna, Mclean et al.(1971) ngalaporkeun yén loba racun oray milik kulawarga Cobra bisa ngahidrolisis indole étil éster, naftalena étil éster jeung butil naftalena éster.Racun oray ieu asalna tina: kobra, kobra beuheung hideung, kobra biwir hideung, kobra emas, kobra Mesir, kobra raja, kobra emas mamba, mamba hideung sareng mamba biwir bodas (D. aw masih terang oray beulah wétan.
Bisa oray bisa ngahidrolisis métil indole étil éster, nu mangrupa substrat pikeun nangtukeun aktivitas kolinesterase dina sérum, tapi venom oray ieu teu némbongkeun aktivitas kolinesterase.Ieu nunjukkeun yén aya ésterase anu teu dipikanyaho dina racun kobra, anu béda sareng kolinesterase.Pikeun ngartos sifat énzim ieu, peryogi pikeun misahkeun deui.
1. Fosfolipase A2
(I) Tinjauan
Fosfolipase mangrupa énzim nu bisa ngahidrolisis gliseril fosfat.Aya 5 rupa fosfolipase di alam, nyaéta fosfolipase A2 jeung fosfolipase.
A. , fosfolipase B, fosfolipase C jeung fosfolipase D. Racun oray utamana ngandung fosfolipase A2 (PLA2), sababaraha venom oray ngandung fosfolipase B, sarta fosfolipase séjén utamana kapanggih dina jaringan sato jeung baktéri.Gbr. 3-11-4 nembongkeun situs aksi fosfolipase ieu dina hidrolisis substrat.
Diantara fosfolipase, PLA2 parantos ditaliti deui.Bisa jadi énzim nu paling ditalungtik dina venom oray.Substratna nyaéta beungkeut éster dina posisi kadua Sn-3-gliserofosfat.Énzim ieu loba kapanggih dina venom oray, venom lebah, venom kalajengking jeung jaringan sato, sarta PLA2 loba pisan di opat venoms oray kulawarga.Kusabab énzim ieu ngarecah sél getih beureum sarta ngabalukarkeun hemolisis, éta ogé disebut "hemolysin".Sababaraha urang ogé nyauran PLA2 hemolytic lecitinase.
Ludeeke mimiti mendakan yén racun oray tiasa ngahasilkeun sanyawa hémolitik ku ngalaksanakeun lésitin ngalangkungan énzim.Salajengna, Delezenne et al.kabuktian yén nalika venom cobra meta dina sérum kuda atawa konéng, éta ngabentuk zat hemolytic.Ayeuna dipikanyaho yén PLA2 tiasa langsung meta dina fosfolipid mémbran éritrosit, ngancurkeun struktur mémbran éritrosit sareng nyababkeun hemolisis langsung;Éta ogé tiasa meta dina sérum atanapi lésitin tambihan pikeun ngahasilkeun lésitin hemolitik, anu nimpah sél getih beureum pikeun ngahasilkeun hemolisis teu langsung.Sanajan PLA2 loba pisan dina opat kulawarga venoms oray, eusi énzim dina rupa venoms oray rada béda.Oray Rattlesnake (C
Racun oray ngan nunjukkeun kagiatan PLA2 anu lemah.tabél 3-11-11 illustrates ngabandingkeun aktivitas PLA2 10 venoms utama oray venomous di Cina.
Tabél 3-11-11 Babandingan kagiatan fosfolipase VIII tina 10 racun oray di Cina.
Racun oray
Ngaleupaskeun gajih
asam alifatik,
Cjumol/mg)
Aktivitas hemolitik CHU50/^ g * ml)
Racun oray
Ngaleupaskeun asam lemak
(^raol/mg)
Aktivitas hemolitik "(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
sabelas
Micracephal ophis
lima titik hiji enol
kalyspallas
8. 68
dua rébu dalapan ratus
gracilis
V, akut
7. 56
** #
Ophiophagus hannah
tilu koma dalapan dua
saratus opat puluh
Bnugarus fasctatus
7,56
dua ratus dalapan puluh
B. multicinctus
hiji titik salapan genep
dua ratus dalapan puluh
Viper jeung russelli
tujuh koma enol tilu
T, mucrosquamatus
hiji koma dalapan lima
Siaménsis
T. stejnegeri
0. 97
(2) Separation jeung purifikasi
Eusi PLA2 dina venom oray téh badag, sarta éta stabil pikeun panas, asam, alkali jeung denaturant, meh gampang purify sarta misahkeun PLA2.Métode umum nyaéta mimiti ngalaksanakeun filtrasi gél dina racun atah, teras ngalaksanakeun kromatografi pertukaran ion, sareng léngkah salajengna tiasa diulang.Ieu kudu dicatet yén freeze-drying of PLA2 sanggeus kromatografi ion-tukar teu kudu ngabalukarkeun aggregation, sabab prosés freeze-drying mindeng ngaronjatkeun kakuatan ionik dina sistem, nu mangrupa faktor penting ngabalukarkeun aggregation of PLA2.Salian métode umum di luhur, métode di handap ieu ogé geus diadopsi: ① Wells et al.② Substrat analog PLA2 dipaké salaku ligan pikeun kromatografi afinitas.Ligan ieu bisa ngabeungkeut PLA2 dina venom oray kalawan Ca2+.EDTA lolobana dipaké salaku eluent.Saatos Ca2+ dipiceun, afinitas antara PLA2 sareng ligan turun, sareng éta tiasa dipisahkeun tina ligan.Batur ngagunakeun 30% solusi organik atawa 6mol/L uréa salaku eluent.③ Kromatografi hidrofobik dipigawé kalawan PheiiylSephar0SeCL-4B pikeun miceun renik PLA2 dina cardiotoxin.④ Antibodi Anti PLA2 dipaké salaku ligan pikeun ngalakukeun kromatografi pangirut dina PLA2.
Sajauh ieu, sajumlah ageung racun oray PLAZ parantos dimurnikeun.Tuh et al.(1977) didaptarkeun PLA2 dimurnikeun tina venom oray saméméh 1975. Dina taun panganyarna, angka nu gede ngarupakeun artikel ngeunaan separation na purifikasi PLA2 geus dilaporkeun unggal taun.Di dieu, urang difokuskeun pamisahan sareng pemurnian PLA ku sarjana Cina.
Chen Yuancong et al.(1981) misahkeun tilu spésiés PLA2 ti venom of Agkistrodon halys Pallas di Zhejiang, nu bisa dibagi kana asam, nétral jeung basa PLA2 nurutkeun titik isoelektrik maranéhanana.Numutkeun karacunanna, PLA2 nétral langkung toksik, anu parantos diidentifikasi minangka Agkistrodotoxin neurotoxin presynaptic.PLA2 alkali kirang toksik, sareng PLA2 asam ampir teu aya karacunan.Wu Xiangfu et al.(1984) dibandingkeun karakteristik tilu PLA2s, kaasup beurat molekular, komposisi asam amino, N-terminal, titik isoelektrik, stabilitas termal, aktivitas énzim, karacunan jeung aktivitas hemolytic.Hasilna nunjukkeun yén aranjeunna gaduh beurat molekul anu sami sareng stabilitas termal, tapi gaduh béda anu signifikan dina aspék séjén.Dina aspék aktivitas énzim, aktivitas énzim asam leuwih luhur batan aktivitas énzim basa;Pangaruh hemolitik énzim basa dina sél getih beureum beurit éta paling kuat, dituturkeun ku énzim nétral, sarta énzim asam boro hemolyzed.Ku alatan éta, disangka yén pangaruh hemolitik PLAZ aya hubunganana sareng muatan molekul PLA2.Zhang Jingkang et al.(1981) geus nyieun kristal Agkistrodotoxin.Tu Guangliang et al.(1983) ngalaporkeun yén PLA toksik kalayan titik isoelektrik 7. 6 diisolasi sareng dimurnikeun tina racun Vipera rotundus ti Fujian, sareng sipat fisik sareng kimiana, komposisi asam amino sareng sekuen 22 résidu asam amino di N. -terminal anu ditangtukeun.Li Yuesheng et al.(1985) ngasingkeun sareng ngamurnikeun PLA2 sanés tina racun Viper rotundus di Fujian.Subunit PLA2 * nyaéta 13.800, titik isoelektrik nyaéta 10.4, sareng kagiatan spésifikna nyaéta 35/xnioI/miri mg. Kalayan lésitin salaku substrat, pH optimal énzim nyaéta 8.0 sareng suhu optimal nyaéta 65 ° C. LD5 disuntik sacara intravena dina mencit.Éta 0,5 ± 0,12 mg / kg.Énzim ieu gaduh pangaruh antikoagulan sareng hemolitik anu jelas.Molekul PLA2 toksik diwangun ku 123 résidu tina 18 rupa asam amino.Molekulna beunghar ku sistein (14), asam aspartat (14) sareng glisin (12), tapi ngan ngandung hiji metionin, sareng terminal N-na nyaéta résidu sérin.Dibandingkeun sareng PLA2 anu diisolasi ku Tuguang, beurat molekular sareng jumlah résidu asam amino tina dua isoénzim sami pisan, sareng komposisi asam amino ogé sami, tapi jumlah résidu asam aspartat sareng prolin rada béda.Guangxi raja kobra venom oray ngandung euyeub PLA2.Shu Yuyan et al.(1989) ngasingkeun PLA2 tina venom, nu boga aktivitas husus 3,6 kali leuwih luhur ti venom aslina, beurat molekul 13000, komposisi 122 résidu asam amino, titik isoelektrik 8,9, sarta stabilitas termal alus.Tina observasi mikroskop éléktron ngeunaan pangaruh PLA2 dasar dina sél getih beureum, éta bisa ditempo yén éta boga pangaruh atra dina mémbran sél getih beureum manusa, tapi teu boga pangaruh atra dina sél getih beureum embe.PLA2 ieu gaduh pangaruh retardasi anu jelas dina laju éléktroforétik sél getih beureum dina manusa, embé, kelenci sareng babi guinea.Chen et al.Énzim ieu tiasa ngahambat agrégasi trombosit anu disababkeun ku ADP, kolagén sareng asam arakidonat natrium.Nalika konsentrasi PLA2 nyaéta 10/xg/ml~lOOjug/ml, agrégasi trombosit sagemblengna dihambat.Lamun platélét dikumbah dipaké salaku bahan, PLA2 moal bisa ngahambat aggregation dina konsentrasi 20Mg/ml.Aspirin mangrupikeun inhibitor cyclooxygenase, anu tiasa ngahambat pangaruh PLA2 dina trombosit.PLA2 tiasa ngahambat agrégasi trombosit ku cara ngahidrolisis asam arakidonat pikeun nyintésis tromboksan A2.Konformasi solusi PLA2 dihasilkeun ku Agkistrodon halys Pallas venom di Propinsi Zhejiang ieu diulik ku cara dichroism sirkular, fluoresensi jeung nyerep UV.Hasil ékspérimén nunjukkeun yén konformasi ranté utama énzim ieu sami sareng jinis énzim anu sami tina spésiés sareng genera sanés, konformasi rangka ngagaduhan résistansi panas anu saé, sareng parobahan struktural dina lingkungan asam tiasa malik.Kombinasi aktivator Ca2+ jeung énzim teu mangaruhan lingkungan résidu triptofan, sedengkeun inhibitor Zn2+ ngalakukeun sabalikna.Cara nilai pH leyuran mangaruhan aktivitas énzim béda ti réagen di luhur.
Dina prosés purifikasi PLA2 tina venom oray, fenomena atra nyaeta venom oray ngandung dua atawa leuwih puncak élusi PLA2.Fenomena ieu tiasa dijelaskeun kieu: ① kusabab ayana isozim;② Hiji jenis PLA2 ieu polymerized kana rupa-rupa campuran PLA2 jeung sagala rupa beurat molekular, lolobana nu aya dina rentang 9 000 ~ 40 000;③ Kombinasi PLA2 jeung komponén venom oray séjén complicates PLA2;④ Kusabab beungkeut amida dina PLA2 dihidrolisis, muatanna robah.① Sareng ② umum, ngan ukur sababaraha pengecualian, sapertos PLA2 dina racun oray CrWa/w
Aya dua kaayaan: ① sareng ②.Kaayaan katilu kapanggih dina PLA2 dina racun oray-oray ieu: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, Viper Paléstina, Viper pasir, jeung oray rattlesnake dahsyat km.
Hasil tina kasus ④ ngajadikeun laju migrasi PLA2 robah salila éléktroforésis, tapi komposisi asam amino teu robah.Péptida bisa dipegatkeun ku hidrolisis, tapi umumna masih kabeungkeut ku beungkeut disulfida.The venom of rattlesnake pit wétan ngandung dua bentuk PLA2, disebut tipe a jeung tipe p PLA2 mungguh.Beda antara dua jenis PLA2 ieu ngan hiji asam amino, nyaeta, glutamin dina hiji molekul PLA2 diganti ku asam glutamat dina molekul PLA2 séjén.Sanaos alesan pasti pikeun bédana ieu henteu écés, umumna dipercaya yén éta aya hubunganana sareng deaminasi PLA2.Lamun PLA2 dina venom viper Paléstina diteundeun haneut jeung venom atah, grup tungtung dina molekul énzim na bakal jadi leuwih ti saméméhna.Ti C PLA2 diisolasi tina venom oray boga dua béda N-terminal, sarta beurat molekul nyaeta 30000. Fenomena ieu bisa jadi dibalukarkeun ku dimer asimétri tina PLA2, nu sarupa jeung dimer simetris dibentuk ku PLA2 dina venom of rattlesnake diamondback wétan. sarta diamondback oray rattlesnake barat.Kobra Asia diwangun ku loba subspésiés, sababaraha di antarana henteu pisan pasti dina klasifikasi.Contona, naon nu baheula disebut Cobra Outer Caspian subspésiés ayeuna dipikawanoh
Eta kudu attributed ka Outer Caspian Sea Cobra.Kusabab aya seueur subspésiés sareng dicampur, komposisi racun oray béda-béda pisan kusabab sumber anu béda, sareng eusi isozim PLA2 ogé luhur.Contona, racun kobra
Sahenteuna 9 rupa isozim PLA2 spésiés r ^ ll kapanggih dina, sarta 7 rupa isozim PLA2 kapanggih dina racun kobra subspésiés Kaspia.Durkin et al.(1981) nalungtik eusi PLA2 jeung jumlah isozim dina venoms oray béda, kaasup 18 venoms cobra, 3 venoms mamba, 5 viper venoms, 16 rattlesnake venoms jeung 3 venoms oray laut.Sacara umum, aktivitas PLA2 racun kobra tinggi, kalawan loba isozim.Aktivitas PLA2 sareng isozim racun viper sedeng.Kagiatan PLA2 tina venom mamba jeung venom oray rattlesnake pisan low atawa euweuh aktivitas PLA2.Aktivitas PLA2 racun oray laut ogé rendah.
Dina taun-taun ayeuna, teu acan dilaporkeun yén PLA2 dina racun oray aya dina bentuk dimer aktip, sapertos oray rattlesnake rhombophora wétan (C. venom oray ngandung tipe a jeung tipe P PLA2, nu duanana diwangun ku dua subunit idéntik. , sarta ngan dimerase boga
Kagiatan.Shen et al.ogé ngusulkeun yén ngan ukur dimer PLA2 tina venom oray mangrupikeun bentuk aktif énzim.Ulikan ngeunaan struktur spasial ogé ngabuktikeun yén PLA2 oray rattles diamondback barat aya dina bentuk dimer.Sanyawa piscivorous
Aya dua PLA ^ Ei jeung E2 racun oray béda, nu 仏 aya dina wangun dimer, dimer aktip, sarta monomér disosiasi na teu aktip.Lu Yinghua et al.(1980) satuluyna ngulik sipat fisik jeung kimia sarta kinétika réaksi E. Jayanthi et al.(1989) ngasingkeun hiji PLA2 dasar (VRVPL-V) tina venom viper.Beurat molekul monomér PLA2 nyaéta 10000, anu ngagaduhan épék ngabahayakeun, antikoagulan sareng busung lapar.Énzim tiasa polimérisasi polimér kalayan beurat molekul anu béda-béda dina kaayaan PH 4.8, sareng darajat polimérisasi sareng beurat molekul polimér ningkat kalayan paningkatan suhu.Beurat molekular polimér anu dihasilkeun dina 96 ° C nyaéta 53.100, sareng kagiatan PLA2 tina polimér ieu ningkat dua kali.
waktos pos: Nov-18-2022